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ICR マウスにおけるアセトアミノフェン誘発肝障害に及ぼす投与時期の影響に関する検討
宮垣愛、五十嵐力也、栗原一樹、茂木肇、木村光利、荻原政彦
第63回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2019.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：北里大学薬学部（白金キャンパス）
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初代培養肝実質細胞における四塩化炭素誘発障害に対するアミノ酸の抗炎症作用の検討
中野雄也、栗田恭輔、栗原一樹、茂木肇、木村光利、荻原政彦
第63回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2019.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：北里大学薬学部（白金キャンパス）
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ラット初代培養肝実質細胞における葉酸の細胞増殖抑制作用に関する検討
中西航汰、田中彰太、関口祐、栗原一樹、内藤浩太、茂木肇、荻原政彦、木村光利
第62回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2018.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：帝京平成大学
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデルとして、初代培養肝実質細胞実験系を独自に開発し、いくつかの増殖因子やサイトカインなどの肝実質細胞増殖促進作用や抑制作用について、その詳細なメカニズムを研究してきた。一連の研究の中で、我々は、水溶性ビタミンの一種である葉酸（以下、FAと略す）に着目した。FAは、DNAの生合成や細胞増殖に必須なビタミンであるが、一方で、結腸がん細胞の増殖抑制や肝再生抑制作用などの細胞増殖抑制作用も報告もされている。そこで、本研究では、上皮増殖因子（以下、EGFと略す）により誘発したラット初代培養肝実質細胞の増殖促進作用に対して、FAがどのような影響を及ぼすのかを検討した。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離・精製し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、種々の濃度のEGFまたはFAを添加した。一定時間培養後、肝実質細胞の核数を計測した。また、western bolt解析法用いて、MAPキナーゼリン酸化活性も測定した。
【結果および考察】FAは、単独では、肝実質細胞の増殖促進作用および抑制作用を示さなかったが、EGF誘発肝実質細胞増殖促進作用に対しては、その用量に依存して細胞増殖抑作用が認められた。一方、EGFによるMAPキナーゼリン酸化活性は影響を及ぼさなかった。上記の結果から、FAは、MAPキナーゼよりも下流の増殖シグナルを抑制することにより、EGF誘発肝実質細胞増殖促進作用を抑制したと考えられる。 -
Serotonin-induced DNA synthesis and proliferation are mediated by autocrine secretion of transforming growth factor-α in primary cultures of adult rat hepatocytes International conference
Kota Naito, Hajime Moteki, Mitsutoshi Kimura and Masahiko Ogihara
18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology Japanese Pharmacological Society / Japanese Society of Clinical Pharmacology and Therapeutics
Event date： 2018.07
Language：English Presentation type：Poster presentation
Venue：Kyoto International Conference Center
Previously, we demonstrated that serotonin (5-hydroxytryotamine; 5-HT)-induced hepatocyte DNA synthesis and proliferation are mediated through 5-HT2B receptor. Moreover, 5-HT2B receptor-mediated hepatocyte mitogenesis involves activation of the Gq/phospholipase C (PLC) pathway and the epidermal growth factor (EGF)/transforming growth factor (TGF)-α receptor tyrosine kinase (RTK)/phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) 2/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. However, how these two signaling pathways are associated with each other remains unknown. Thus we hypothesized that 5-HT2B receptor stimulated by 5-HT induces secretion of a putative primary mitogen (e.g., TGF-α, insulin-like growth factor (IGF)-I) via the Gq/PLC pathway in primary cultured hepatocytes, followed by induction of DNA synthesis and proliferation that is mediated by the EGF/TGF-α RTK/PI3K/ERK2/mTOR pathway.
Hepatocytes were isolated from normal livers by the two-step in situ collagenase perfusion to facilitate disaggregation of the adult rat liver. Isolated hepatocytes were plated onto collagen-coated plastic culture dishes and incubated for 3-h in Williams’ medium E supplemented with 5% newborn calf serum, 0.1 nM dexamethasone in 5% CO2 in air at 37℃ to allow attachment. The medium was changed to Williams’ medium E without serum and dexamethasone, and 5-HT with or without test substances was added.
We investigated effects of monoclonal antibody against TGF-α (1-100 ng/ml) or IGF-I (1-100 ng/ml) on 5-HT-induced hepatocytes DNA synthesis and proliferation. The TGF-α monoclonal antibody, but not IGF-I monoclonal antibody inhibited hepatocytes DNA synthesis and proliferation induced by 5-HT in a dose-dependent manner. Next, we tested to determine autocrine secretion of TGF-α from cultured hepatocytes. 5-HT (10-6 M) significantly increased TGF-α levels in the culture medium. The maximum TGF-α concentration (30 pg/ml) peaked 10 min after addition of 5-HT. The TGF-α secretion induced by 5-HT was completely blocked by a 5-HT2B receptor antagonist (LY272015). These results suggest that the proliferative mechanism of action of 5-HT is mediated by 5-HT2B receptor, and stimulation of 5-HT2B receptor increases autocrine TGF-α secretion from primary cultured hepatocytes.
In conclusion, our data indicate that 5-HT stimulates DNA synthesis and proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes by acting via autocrine secretion of TGF-α induced by the serotonin 5-HT2B receptor/Gq/PLC pathway. -
Signal Transduction Mechanism for 5-HT2B Receptor-Stimulated Autocrine Secretion of Transforming Growth Factor-α in Primary Cultures of Adult Rat Hepatocytes. International conference
Hajime Moteki, Kota Naito, Mitsutoshi Kimura and Masahiko Ogihara.
18th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology Japanese Pharmacological Society / Japanese Society of Clinical Pharmacology and Therapeutics
Event date： 2018.07
Language：English Presentation type：Poster presentation
Venue：Kyoto International Conference Center
In the past decade, we have been investigated the cellular and molecular mechanisms of action of various growth factors, cytokines and autacoids using primary culture of adult rat hepatocytes in vitro. We focused on serotonin (5-HT) in a previous study. 5-HT mediates many types of biological responses such as platelet aggregation, vascular constriction, and cell proliferation and mediates a diverse array of responses by interacting with 5-HT receptor subtype in mammals. In the previous report, we demonstrated that 5-HT-induced hepatocyte DNA synthesis and proliferation are mediated through 5-HT2B receptors. Moreover, their proliferative effects were brought about by autocrine secretion of transforming growth factor-α (TGF-α). In this study, we examined the mechanisms responsible for regulating the rapid increase in TGF-α concentrations after stimulation of 5-HT2B receptors.
Hepatocytes were isolated from normal livers by the two-step in situ collagenase perfusion. Hepatocytes at a cell density of 3.3×104 cells/cm2 were plated and allowed to attach for 3 h. After changing medium, the hepatocyte were cultured with selective signal transducer inhibitors in the presence of 5-HT or selective 5-HT2B receptor agonist (BW723C86). TGF-α levels were determined with an ELISA kit (Calbiochem Co.).
TGF-α levels in the culture medium increased significantly versus baseline within 5 min in response to 5-HT or BW723C86, and the maximum TGF-α level was reached 10 min after 5-HT or BW723C86 stimulation. Secretion of TGF-α into the culture medium was inhibited by addition of the selective 5-HT2B receptor antagonist (LY272015), phospholipase C (PLC) inhibitor (U-73122), intracellular Ca2+ chelator (BAPTA/AM) and somatostatin. Moreover, in addition to the above inhibitors, receptor tyrosine kinases (RTK) inhibitor (AG1478), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor (LY294002), mitogen-activated protein extracellular kinase (MEK) inhibitor (PD98059) and mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor (rapamycin) completely inhibited the 5-HT- or BW723C86-induced hepatocyte mitogenesis without affecting culture medium TGF-α levels.
In conclusion, our data indicate that stimulation of the serotonin 5-HT2B receptor subtype induced PLC activation, possibly via Gq protein, which increases intracellular Ca2+ levels, resulting in autocrine TGF-α secretion. The secreted TGF-α then induced hepatocyte DNA synthesis and proliferation by activating a secondary pathway, the EGF/TGF-α RTK/PI3K/ MEK/mTOR pathway. -
セロトニンの肝実質細胞増殖促進作用に対する増殖関連シグナル伝達因子活性の経時的変化の検討
栗原一樹、内藤浩太、茂木肇、木村光利、荻原政彦
日本薬学会 第138年会（金沢） 日本薬学会
Event date： 2018.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：もてなしドーム（金沢）
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデル実験系としてラット初代培養肝実質細胞実験系を独自に開発し、これまでにいくつかの増殖因子やサイトカインによる肝実質細胞増殖促進作用機構について詳しく研究してきた。一連の研究の中で、オータコイドの一種であるセロトニン(5-hydroxytryptamine ; 5-HT)が、単独で肝実質細胞のDNA合成能を増加させ、細胞増殖を促進することを見出した。さらに、5-HTの肝実質細胞増殖促進作用は、receptor tyrosine kinase(RTK)、MAPK/ERK kinase(MEK)、mammalian target of rapamycin(mTOR)等が深く関与することが明らかとなった。そこで、本研究では、5-HT刺激による上記のようなシグナル伝達因子のリン酸化活性を経時的に追跡することで、各因子間における活性化の順序を推測し、5-HT受容体から肝実質細胞増殖に至る経路を検討した。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離・精製し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、5-HTなどの試薬を添加した。一定時間培養後、細胞を回収し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離し、western blot解析法によりタンパク質のリン酸化活性を評価した。
【結果及び考察】5-HT刺激により肝実質細胞のEGF/TGF-α RTK、MAPK、p70S6Kにリン酸化活性が認められた。これらタンパク質のリン酸化活性は、5-HT刺激後それぞれ約10分、約20分、30分で一過性のピークが認められた。また、AG1478は、EGF/TGF-α RTK、MAPK、p70S6Kを、PD98059は、MAPK、p70S6K を、ラパマイシンは、p70S6Kをそれぞれ抑制した。以上のことから、5-HTの肝実質細胞増殖シグナルは、EGF/TGF-α-RTK、MAPK、p70S6Kの順に進むと推測された。 -
セロトニンによるEGFR/MAPK経路の活性化に対する特異的シグナル伝達因子阻害薬の効果の検討
内藤浩太、栗原一樹、茂木肇、木村光利、荻原政彦
日本薬学会 第138年会（金沢） 日本薬学会
Event date： 2018.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：もてなしドーム（金沢）
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデル実験系としてラット初代培養肝実質細胞実験系を独自に開発し、いくつかの増殖因子やサイトカインによる肝実質細胞増殖促進作用機構について詳しく研究してきた。一連の研究の中で、我々は、オータコイドの一種であるセロトニン(5-HT)が単独で肝実質細胞のDNA合成能を上昇させ、細胞増殖を促進することを見出した。そこで、本研究では、5-HTによる増殖に関連したタンパク質(mitogen-activated protein kinase(MAPK)やp70 ribosomal S6 kinase(p70S6K)など)のリン酸化活性の変化をwestern blot解析法を用いて検出し、より詳細な細胞増殖促進機構を検討した。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離・精製し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、5-HTなどの試薬を添加した。一定時間培養後、細胞を回収し、SDS-PAGEによりタンパク質を分離し、western blot解析法によりタンパク質のリン酸化活性を評価した。
【結果及び考察】5-HTは、EGF/TGF-α receptor tyrosine kinase(RTK)、MAPK、p70S6Kのリン酸化活性を有意に増加した。また、これらのリン酸化活性はLY272015(選択的5-HT2B受容体遮断薬)により完全に抑制された。さらに、U-73122(phospholipase C (PLC)阻害薬)、BAPTA/AM(細胞内Ca2+キレート剤)、AG1478(RTK阻害薬)も同様に5-HT誘発EGF/TGF-α RTK、MAPK、p70S6Kのリン酸化活性を完全に抑制した。以上のことから、5-HTの肝実質細胞増殖促進シグナルとしては、少なくともEGF/TGF-α RTK、MAPK及びp70S6Kを介していると推測された。また、これらのリン酸化活性には5-HT2B受容体、PLCの活性化、細胞内Ca2+濃度の上昇が深く関与していることが明らかとなった。 -
アセトアミノフェン誘発肝障害マウスにおけるシステインの 肝障害抑制作用に関する検討
木下和、石井梨恵、仲村翔太郎、青柳颯太、内藤浩太、茂木肇、木村光利、荻原政彦
第61回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2017.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：慶応義塾大学薬学部
システイン及びグリシンは、グルタチオンを構成する内の一種である。グルタチオンは、フリーラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、各種酵素のSH供与体であり、抗酸化成分としても知られる。つまり、細胞内のグルタチオン濃度を高めることにより、ミトコンドリアや細胞が、活性酸素による障害から、抗酸化作用によって防御される。またシステインは、四塩化炭素(CCl4)やブロムベンゼン(BrBz)誘発肝障害ラットに対し、また、グリシンはガラクトサミン肝炎ラットに対して、抗炎症作用による肝障害軽減効果を示すことが報告されている。そこで、本研究では、アセトアミノフェン(APAP)による肝障害に対し、システイン及びグリシンが肝障害抑制作用を示すか否か、血清トランスアミナーゼを測定することで検討することを目的とした。 -
ラット初代培養肝実質細胞におけるEGF誘発細胞増殖促進作用に対する カルバコールの抑制効果に関する研究
小鷹麻衣、河原井珠美、鈴木里奈、杉谷幸子、 内藤浩太、茂木肇、木村光利、荻原政彦
第61回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2017.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：慶応義塾大学薬学部
【目的】当研究室では、肝再生現象の解明の一端として、様々な増殖因子およびサイトカインの増殖のメカニズムについてラット初代培養肝実質細胞系を用いて検討してきた。一連の研究の中で我々はアセチルコリン誘導体のカルバコール(CCh)がEGFの肝実質細胞増殖促進作用を抑制することを見出した。そこで、本研究では成熟ラット初代培養肝実質細胞についてCChがどのようなシグナルを介してEGFの増殖シグナルを抑制しているのかを特異的シグナル伝達因子阻害薬を用いて検討した。
【方法】in situコラゲナーゼ還流法を用いてWistar系雄性ラットの肝実質細胞を単離、精製しコラーゲンコートされたプラスチックディッシュに播種し、37℃、5%CO2条件下で3時間培養した。細胞接着後、無血清培地(MEM(-))に交換し、種々の薬物を添加し、一定時間培養した。培養後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で接着している細胞を洗浄し、Triton X-100含有0.1Mクエン酸溶液で細胞膜を溶解し、裸核を得た。これをトリパンブルー溶液で核を染色し、血球計算盤を用いて核数を計測した。
【結果・考察】EGF誘発肝実質細胞細胞増殖促進作用は、カルバコール(CCh)の用量に依存して抑制された。その抑制効果はM3受容体阻害薬(1-Benzyl-3-hydroxy piperidine)、U73122、GF109203Xで抑制された。少なくともM3受容体、ホスホリパーゼC(PLC)、プロテインキナーゼC(PKC)が関与していることが示された。 -
ラット初代培養肝実質細胞におけるインターロイキン1βの増殖促進作用機構に関する検討
内藤 浩太、茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
日本薬学会第137年会 日本薬学会
Event date： 2017.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデル実験系としてラット初代培養肝実質細胞実験系を独自に開発し、これまでにいくつかの増殖因子やサイトカインによる肝実質細胞増殖促進作用機構について詳しく研究してきた。一連の研究の中で、我々は、炎症性サイトカインの一種であるインターロイキン1(IL-1)に着目した。IL-1は、構造上の違いからIL-1α、IL-1β、IL-1raに分類され、主に肝臓のクッパー細胞から産生される。IL-1は感染症や炎症に関与するほか、細胞増殖の調節において重要な役割を示すといわれており、初代培養肝実質細胞においてもIL-1のDNA合成促進作用や細胞増殖促進作用がいくつか報告されている。しかし、詳しい作用機構は明らかになっていない。そこで、我々は初代培養肝実質細胞におけるIL-1のDNA合成及び細胞増殖促進作用のシグナル伝達作用機構を検討した。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離・精製し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、種々の濃度のIL-1または特異的シグナル伝達因子阻害薬を添加した。一定時間培養後、肝実質細胞のDNA合成能及び核数を計測した。
【結果及び考察】IL-1βは用量及び培養時間依存的に有意なDNA合成促進及び細胞増殖促進作用を示した。一方、IL-1αは肝実質細胞における増殖促進作用に対して影響を及ぼさなかった。また、IL-1受容体アンタゴニストであるIL-1ra、U-73122、AG1478、LY294002、PD98059、ラパマイシンはそれぞれIL-1βによる肝実質細胞のDNA合成促進及び増殖促進作用を完全に抑制した。このことから、IL-1βによる肝実質細胞増殖促進作用は、少なくともIL-1β受容体を介し、phospholipase C (PLC)、receptor tyrosine kinase、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)、MAPK/ERK kinase (MEK)、mammalian target of rapamycin (mTOR)が深く関与していることが明らかとなった。 -
Effect of serotonin on phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Hajime Moteki, Kota Naito, Mitsutoshi Kimura, Masahiko Ogihara
第90回日本薬理学会年会 日本薬理学会
Event date： 2017.03
Language：English Presentation type：Poster presentation
Venue：長崎ブリックホール
The involvement of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in the serotonin (5-HT)-induced hepatocyte DNA synthesis and proliferation was investigated by using western blot analysis in primary cultures of adult rat hepatocytes. A phosphorylated ERK2, but not ERK1, was significantly induced after 20 min stimulation, peaking at 30 min after addition of 5-HT or selective 5-HT2B receptor agonist, BW723C86. The 5-HT- or BW723C86-induced ERK2 phosphorylation was completely inhibited by 5-HT2B receptor antagonist (LY272015), PLC inhibitor (U-73122) and RTK inhibitor (AG1478), PI3K inhibitor (LY294002) and MEK inhibitor (PD98059). On the other hand, mTOR inhibitor (rapamycin), which inhibited hepatocyte DNA synthesis and proliferation induced by 5-HT or BW723C86, did not affect the phosphorylation of ERK2 induced by 5-HT or BW723C86. These results suggest that the proliferative mechanism of action of 5-HT is mediated mainly through 5-HT2B receptor/Gq/PLC and EGF/TGF-alpha RTK/PI3K/ERK2/mTOR signaling pathways. In addition, the results also suggest that these signal transducers are upstream elements of ERK2, and mTOR is a downstream element of ERK2.
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Serotonin-induced hepatocyte mitogenesis is mediated by epidermal growth factor /transforming growth factor-alpha receptor tyrosine kinase pathway.
Kota Naito, Hajime Moteki, Mitsutoshi Kimura, Masahiko Ogihara
第90回日本薬理学会年会 日本薬理学会
Event date： 2017.03
Language：English Presentation type：Poster presentation
Venue：長崎ブリックホール
The involvement of epidermal growth factor (EGF)/ transforming growth factor (TGF)-alpha receptor tyrosine kinase (RTK) in the serotonin (5-HT)-induced DNA synthesis and proliferation was investigated by using western blot analysis in primary cultures of adult rat hepatocytes. Both 5-HT and selective 5-HT2B receptor agonist, BW723C86, stimulated phosphorylation of EGF/TGF-alpha RTK. 5-HT- or BW723C86-induced EGF/TGF-alpha RTK phosphorylation was completely inhibited selective 5-HT2B receptor antagonist (LY272015), PLC inhibitor (U-73122) and RTK inhibitor (AG1478). On the other hand, 5-HT2B receptor agonist-induced EGF/TGF-alpha RTK phosphorylation was not affected by specific inhibitors of growth-related signal transducers (e.g., PD98059, LY294002 and rapamycin) which inhibited hepatocyte proliferation induced by 5-HT or BW723C86. These results suggest that the mechanism of action of 5-HT is mediated mainly through 5-HT2B receptor-stimulated Gq/PLC, which, in turn, lead to the activation of EGF/TGF-alpha RTK and PI3K/MAPK/mTOR signaling pathways in primary cultured hepatocytes.
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70%部分肝切除ラットにおける血清アミノ酸の変動に関する検討
阪本 恵、田中 里、内藤 浩太、茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
第60回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2016.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：東京大学大学院薬学系研究科、山上会館
【目的】肝再生時の肝臓は、増殖因子やサイトカインだけでなく、ホルモンやビタミン、アミノ酸などの影響も受けることが知られている。近年、アミノ酸による肝細胞増殖促進作用が注目されており、当研究室では、初代培養肝実質細胞において、分岐鎖アミノ酸のうちロイシンにのみ細胞増殖促進作用があることを見出した。肝障害時の血中アミノ酸量の変動に関しては、分岐鎖/芳香族アミノ酸比の低下が知られているが、その他のアミノ酸の血中濃度推移は明らかになっていない。そこで、本実験では、肝再生モデルである70%部分肝切除ラットを用いて、様々なアミノ酸の血清濃度を定量し、肝切除後のアミノ酸の経時的な変動を検討した。
【方法】ラット(Wistar系、雄性)にエーテル麻酔下で70%部分肝切除術を施行し、切除前を0時間として、一定期間飼育した。その後、下大静脈より採血を行い、得られた血清を除タンパクし、4-fluoro-7-nitorobenzofurazan(NBD-F)でアミノ酸を誘導体化した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて血清のアミノ酸を定量した。
【結果・考察】測定したほとんどの血清アミノ酸濃度は、切除前と比べて肝切除後早期に上昇傾向を示した。このうちロイシン、グルタミン、プロリン、グリシンが切除前に対して有意に上昇し、リジンは切除前に対して変化を示さなかった。以上より切除後早期に上昇したアミノ酸は、肝再生初期に肝細胞の増殖に影響を及ぼしている可能性が考えられる。 -
セロトニンの成熟ラット初代培養肝実質細胞における細胞増殖促進機構に関する検討
内藤 浩太、茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
日本薬学会第136年会 日本薬学会
Event date： 2016.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：パシフィコ横浜
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデル実験系としてラット初代培養肝実質細胞実験系を独自に開発し、いくつかの増殖因子(上皮成長因子；EGF、肝細胞増殖因子;HGFなど）について、肝実質細胞に対する増殖促進作用、増殖抑制作用あるいは増殖修飾作用などを詳しく研究してきた。一連の研究の中で、我々は、オータコイドであるセロトニン（5-HT）に着目した。セロトニンは、抗うつ作用や血小板凝集、腸の蠕動運動亢進などマルチな作用を示す生理活性物質であり、生体の恒常性維持に寄与している。近年では5-HTによる細胞増殖促進作用が様々な細胞において報告されているが、詳しい作用メカニズムに関しては解明されていない。そこで本研究では、成熟ラット初代培養肝実質細胞を用いて5-HTによる肝細胞増殖促進作用機構をDNA合成能及び肝実質細胞の核数を計測することにより検討した。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、種々の濃度の5-HTまたは特異的シグナル伝達因子阻害薬を添加した。一定時間培養後、肝実質細胞のDNA合成能及び核数を計測した。
【結果及び考察】5-HTは、肝実質細胞に対して、用量及び培養時間に依存して有意な細胞増殖促進作用を示した。更に、その細胞増殖促進作用は、AG1478、LY294002、PD98059、ラパマイシンにより各々完全に抑制されたことから、5-HTによる肝実質細胞増殖促進作用には、少なくとも受容体tyrosine kinase、phosphoinositide 3-kinase(PI3K)、MAPK/ERK kinase(MEK)、mammalian target of rapamycin(mTOR)が深く関与していることが明らかとなった。 -
ラット初代培養肝実質細胞に対するインターロイキン1βの細胞増殖 促進作用はトランスフォーミング増殖因子αの分泌を介している
茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
第89回 日本薬理学会年会 日本薬理学会
Event date： 2016.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：パシフィコ横浜
We investigated the effects of interleukin-1β（IL-1β) on DNA synthesis and proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes in order to elucidate the intracellular signal transduction pathways. The results showed that hepatocyte parenchymal cells maintained in a serum-free, defined medium synthesized DNA and proliferated in the presence of IL-1β in a time- and dose-dependent manner, which were inhibited by a selective IL-1β receptor antagonist IL-1ra (20 ng/ml), phospholipase C (PLC) inhibitor U-73122 (10-6 M), and somatostatin (10-6 M). Addition of a monoclonal antibody against transforming growth factor (TGF)-α, but not a monoclonal antibody against insulin-like growth factor-I, to the culture dose-dependently inhibited IL-1β(10 ng/ml)-induced hepatocyte mitogenesis. Culture medium TGF-α levels increased significantly within 3 min in response to IL-1β (10 ng/mL) from baseline levels. Peak TGF-α levels (33 pg/ml) were reached at 10 min after IL-1β stimulation. These results indicate that the proliferative mechanism of action of IL-1β is mediated through an increase in autocrine secretion of TGF-α from primary cultured hepatocytes.
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ラット初代培養肝実質細胞に対するインターロイキン1βの増殖促進作用の検討
内藤 浩太、茂木 肇 、木村 光利、荻原 政彦
第89回 日本薬理学会年会 日本薬理学会
Event date： 2016.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：パシフィコ横浜
We studied the effects of interleukin 1β (IL-1β on DNA synthesis and cell proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes in order to elucidate the mechanisms of its action. Hepatocyte parenchymal cells maintained in a serum-free, defined medium synthesized DNA and proliferated in the presence of IL-1β (3-30 ng/mL), but not IL-1α (0.1-30 ng/mL) in a time- and dose-dependent manner. A selective IL-1β receptor antagonist, IL-1ra (20 ng/ml) and a specific phospholipase C (PLC) inhibitor, U-73122 (10-6 M) as well as specific inhibitors of growth-related signal transducers, such as, AG1478, LY294002, PD98059, and rapamycin completely inhibited the IL-1β (10 ng/ml)-induced hepatocyte DNA synthesis and proliferation. Western blot analysis showed that IL-1β significantly stimulated phosphorylation of EGF/TGF-α receptor tyrosine kinase (RTK) (p175 kDa) and extracellular-signal regulated kinase-2(ERK-2) activation within 10 min. These results suggest that the proliferative mechanism of action of IL-1β is mediated mainly through IL-1β receptor-stimulated Gq/PLC and EGF/TGF-α-RTK/PI3K/ERK2/mTOR signaling pathways in primary cultured hepatocytes.
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70%部分肝切除ラットにおけるプロスタグランジンE2の肝再生促進作用に関する組織化学的研究
内藤 浩太、北澤 知英、茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
第132回日本薬理学会関東支部会 日本薬理学会関東支部
Event date： 2015.07
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：明海大学浦安キャンパス
【目的】当研究室では、肝再生現象のin vitroモデル系として初代培養肝実質細胞を用いて、肝再生を促進する薬物の探索を行ってきた。その一連の研究の中で、プロスタグランジンE₂(PGE₂)が単独で肝実質細胞の増殖を促進させることを見出した。そこで、本研究では、in vivo実験系である70%部分肝切除ラットを用いてPGE₂による肝再生促進作用を検討するために、肝重量変化、DNA合成能、血清トランスアミナーゼ活性を測定した。なお、DNA合成能に対するPGE₂の効果は、DNA合成期(S期)の核に特異的に取り込まれた5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)を免疫組織化学的手法により測定することにより評価した。
【方法】ラット(Wistar系、雄性)にエーテル麻酔下で70%部分肝切除術を施行し、術直後より、PGE₂を1日1回腹腔内投与した。術後、一定期間経過したモデル動物にBrdU(50 mg/kg,i.p.)を投与し、残余肝を摘出し、その肝重量を測定した。その後、摘出した残余肝は、ホルマリン固定、パラフィン包埋した後、ミクロトームにより薄切して組織切片を作成した。S期の核に取り込まれたBrdUは、BrdU Immunohistochemistry Kit(Exalpha Biologicals社)を用いて染色し、その染色された細胞割合(Labeling Index;LI)を計測した。
【結果及び考察】70%部分肝切除ラットに対して、PGE₂(10 μg/kg,i.p.)投与群では、術後3日目においてcontrol(0.2%エタノール)群と比較して有意な肝重量の増加が認められた。一方、DNA合成能の変動は、術後1日目において一過性のピークが認められ、術後1日目のLIは、PGE₂(10 μg/kg,i.p.)投与群においてcontrol群に対し、約2.3倍と有意な上昇を示し、DNA合成能の促進が認められた。また、血清トランスアミナーゼ活性は、PGE₂(10 μg/kg,i.p.)投与群において術後2日目、3日目でcontrol 群に対し、有意な低下を示した。以上の結果より、PGE₂は、70%部分肝切除ラットにおいて、術後早期から肝実質細胞のDNA合成能を有意に上昇させ、肝再生を促進することが示された。 -
L-Ascorbic acid and its analogs accelerate in vivo liver regeneration in 70% partially hepatectomized rats.
Event date： 2015.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
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Signal transduction mechanism for potential by α1- and β2-adrenergic agonists of l-ascorbic acid-induced DNA synthesis and proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Event date： 2015.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
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70％部分肝切除マウスにおけるカルバコールの肝再生促進作用に関する研究
野呂 昌代、矢田 祐平、茂木 肇、木村 光利、荻原 政彦
第58回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2014.10
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：昭和薬科大学
【目的】当研究室では、従来から肝再生現象のin vivoモデル系として70％部分肝切除マウスを用い、肝再生を促す薬物の探索などを行ってきた。一連の研究で、カルバコールに注目した。近年、カルバコールは肥満モデル動物において肝細胞核抗原の増加作用を示すことが報告されている。そこで、本研究では、70％部分肝切除マウスに対するカルバコールの肝再生促進作用を検討するため、肝重量の測定およびBrdUを用いた免疫組織化学的手法によるDNA合成能の測定を行った。
【方法】マウス（ddY系、雄性）にエーテル麻酔下で70％部分肝切除術を施行した。術直後より、カルバコールを1日1回腹腔内投与した。術後、一定期間経過したモデル動物にBrdU（50 mg/kg, i.p.）を投与し、肝重量を測定した。摘出した肝臓は、ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、ミクロトームにより薄切して組織切片を作成した。S期の核に取り込まれたBrdUはBrdU Immunohistochemistry kit(Exalpha Biologicals)により染色し、その染色された割合(Labeling index ;LI)を計測した。
【結果及び考察】70％部分肝切除後の残余肝重量は、カルバコール投与により早期から用量に依存して増加した。また、DNA合成能の変動は、術後1.5～2日目においてLIの一過性のピークが認められた。Control群（生理食塩水投与）のLIは1.5日目で6.6％であったのに対し、カルバコール投与群のLIは10.4％であり、DNA合成能の有意な上昇が認められた。これらの結果から、カルバコールは、70％部分肝切除マウスにおいて、術後早期から肝実質細胞のDNA合成能を優位に上昇させ、肝再生を促進することが示された。