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S-アリル-Lシステインは成長ホルモン受容体を刺激して肝実質細胞の増殖を促進する
茂木 肇、荻原 政彦、木村 光利
日本薬学会第145年会（福岡） 2025.03 日本薬学会
Event date： 2025.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：福岡国際会議場 Country：Japan
【目的・方法】S-アリル-L-システイン（SAC）は、熟成ニンニクに含まれる含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化作用や抗炎症作用といった薬理作用が報告されている。近年、SACは細胞増殖促進作用も有していることが報告されており、我々は以前、初代培養肝実質細胞においてSACがヤーヌスキナーゼ（JAK）2/ホスホリパーゼC（PLC）経路を介してインスリン様増殖因子1型（IGF-I）を分泌することにより細胞増殖促進作用を示したことを明らかとした。このJAK2/PLC/IGF-I分泌機構は、成長ホルモン（GH）でも確認されていることから、我々は、SACがGH受容体に結合すると仮説を立てた。そこで本研究では、GH受容体に対する免疫蛍光法（GH受容体イメージング）を用いて、SACまたはGH存在下において抗GH受容体モノクローナル抗体（抗GHR mAb）とGH受容体との親和性に関する検討を行った。
【結果・考察】肝実質細胞のGH受容体は、蛍光色素で標識された抗GHR mAbにより蛍光シグナルを発した。一方、SAC存在下における蛍光シグナルはSAC不在下と比較して減少する傾向が認められ、その効果はSACの用量に依存した。GHにおいても同様の傾向が認められた。これに対し、S-メチル-L-システインでは、蛍光シグナルの減少は認められなかった。これらの結果から、SACは肝実質細胞膜に発現しているGH受容体と結合することにより、肝実質細胞増殖促進作用を発揮することが明らかとなった。 -
Triiodothyronine promotes hepatocyte proliferation through EGF/TGF-α RTK/PI3K/ERK pathway in primary cultured rat hepatocytes.
Hajime Moteki, Masahiko Ogihara and Mitsutoshi Kimura
2025.03
Event date： 2025.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
We have previously investigated the intracellular mechanisms of growth factors, cytokines, and hormones secreted during liver regeneration using primary cultured hepatocytes. In the course of this study, we discovered that triiodothyronine (T3) promotes hepatocyte proliferation. T3, a thyroid hormone (along with thyroxine: T4, and reverse T3: rT3), is an amino acid-derived hormone that enhances the metabolic efficiency of various cells. Its secretion has been observed to increase during liver regeneration. However, the exact mechanisms of the T3 promotes hepatocyte proliferation remain unclear. The aim of this study was to examine the detailed signal transduction pathways involved in T3-induced cell proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes. Hepatocyte proliferation was assessed by counting the number of nuclei and measuring the incorporation of [3H]-thymidine incorporation into DNA synthesis. T3-stimulated hepatocytes exhibited a proliferative effect that was both culture time- and dose-dependent, with effective concentrations ranging from 10⁻¹⁰ to 10⁻⁵ M. In contrast, neither T4 nor rT3 elicited any proliferative response in hepatocytes. Furthermore, the proliferative effect induced by T3 was significantly suppressed by the specific EGF/TGF-α receptor tyrosine kinase inhibitor AG1478, the PI3K inhibitor LY294002, and the MEK inhibitor PD98059. While T3 is known to cross the cell membrane and bind to thyroid hormone receptors in the nucleus, these results suggest that the hepatocyte proliferative effect induced by T3 may involve not only nuclear receptors but also the EGF/TGF-α RTK/PI3K/ERK pathway.
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Proliferative effects of erythropoietin in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Yuka Kano, Rina Ueki, Harua Nonaka, Hajime Moteki, Masahiko Ogihara, Mitsutoshi Kimura
2024.03
Event date： 2024.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
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Proliferative effects of thyroid hormones on primary cultured of adult rat hepatic parenchymal cells
Hajime Moteki, Miho Akimoto, Masahiko Ogihara, Mitsutoshi Kimura
2024.03
Event date： 2024.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
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Effects of S-allyl-L-cysteine on binding to growth hormone receptors in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Hajime Moteki, Masahiko Ogihara and Mitsutoshi Kimura
2023.12
Event date： 2023.12
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
We previously reported that S-allyl-L-cysteine (SAC)-induced cell proliferation was involved in intracellular insulin-like growth factor (IGF)-I secretion via the Janus kinase 2 (JAK2) / phospholipase C (PLC) pathway in primary cultures of adult rat hepatocytes. Furthermore, we demonstrated that growth hormone (GH) stimulates the GH receptors in cultured hepatocytes to promote IGF-I secretion through the JAK2/PLC pathway. In this study, we investigated whether SAC binds to GH receptors by examining the affinity between the anti-GH receptor monoclonal antibody (anti-GHR mAb) and GH receptors in the presence of SAC or GH using a GH receptor immunofluorescence technique (GH receptor imaging). The GHR in hepatocytes emitted a fluorescent signal when labeled with a fluorescent dye-coupled anti-GHR mAb. Interestingly, SAC-treated fluorescent signals tended to decrease compared to the absence of SAC, and this effect was dependent on SAC doses. A similar trend was observed in GH treatment. In contrast, S-methyl-L-cysteine, which is a structural analog of SAC and has no hepatocyte proliferation capacity, did not show any decrease in fluorescence intensity. These results indicate that SAC shares the same binding site as GH for the GH receptor. In other words, SAC induces JAK2 phosphorylation by binding to GH receptors expressed on the hepatocyte membrane.
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Potentiating effects of α1-adrenoceptor agonists on S-allyl-L-cysteine-included ERK2 phosphorylation in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Hajime Moteki, Masahiko Ogihara, Mitsutoshi Kimura
2023.03
Event date： 2023.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
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Effects of S-allyl-L-cysteine on phosphorylation of insulin-like growth factor type-I receptor tyrosine kinase in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Hajime Moteki, Masahiko Ogihara, Mitsutoshi Kimura
2022.12
Event date： 2022.11 - 2022.12
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Country：Japan
We previously reported that S-allyl-L-cysteine (SAC)-induced cell proliferation was involved in intracellular IGF-I secretion via Janus kinase 2 (JAK2) / phospholipase C (PLC) pathway in primary cultures of adult rat hepatocytes. In this study, we investigated the involvement of IGF-I receptor tyrosine kinase (RTK) in the SAC-induced hepatocyte proliferation by using Western blot analysis. IGF-I RTK (p95 kDa) phosphorylation in cultured hepatocytes peaked 20 min after SAC stimulation. SAC-induced IGF-I RTK phosphorylation was suppressed not only by the IGF-I RTK inhibitor AG538 but also by the JAK2 inhibitor TG101209 and the PLC inhibitor U-73122. Furthermore, the SAC-induced cell proliferation was significantly suppressed by PI3 kinase inhibitor LY294002, MEK inhibitor PD98059, and mTOR inhibitor rapamycin. These results suggested that the SAC-induced IGF-I RTK phosphorylation is mediated by JAK2/PLC phosphorylation and subsequently released IGF-I phosphorylates IGF-I RTK. Then hepatocyte proliferation may be induced via IGF-I RTK / PI3 kinase / MEK / mTOR pathway.
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HepG2細胞の増殖能に対するS-allyl-L-cysteineおよびそのシクロデキストリン包接化合物の影響に関する研究
斎藤 紘生、立川 吏乃、茂木 肇、谷川 尚、井上 裕、木村 光利
第66回日本薬学会関東支部大会 2022.09 日本薬学会関東支部
Event date： 2022.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：横浜薬科大学 Country：Japan
【目的】S-Allyl-L-cysteine (SAC) は、ニンニクに多く含まれる含硫アミノ酸であり、種々のがん細胞に対して、細胞増殖抑制作用を示すことが報告されている。Cyclodextrin (CD) は、D-グルコース同士がα-1,4結合した環状オリゴ糖であり、それぞれグルコース数に応じてα型、β型およびγ型に分類される。そこでCDsを用いてSACとの包接複合体を調製により、CDの違いにより包接挙動に違いが考えられる。そこで本研究は、SACおよびそのSAC/CDs包接化合物がHepG2細胞増殖抑制作用にどのような影響があるか比較することによりSACの効果の違いについて考察した。
【方法】35φdishに播種し接着したHepG2細胞（1.0×10⁴ cells/cm²）に、SACおよびSAC/CDs包接化合物を添加し、一定期間培養した。培養後、Triton-X100でHepG2細胞から裸核を得て、その核数を血球計算盤により計測した。
【結果および考察】培養3日目におけるHepG2細胞の増殖に対して、SAC（10-6M）単独添加群は、コントロール群と比較して約14％の減少が認められた。これに対し、β-CD/ SAC群は、約30％の核数の減少が認められた。一方、α-およびγ-CD/SAC群は、更なる核数の減少効果は認められなかった。β-CD/ SACは、S-allyl基が露出しているため、SACのHepG2細胞増殖抑制作用には、S-allyl基が重要であると考えられる。 -
初代培養肝実質細胞における成長ホルモンのJAK2/ PLC/ IGF-I受容体チロシンキナーゼ経路を介した細胞増殖促進作用に関する研究 International conference
茂木 肇、荻原 政彦、木村 光利
日本薬学会第142年会（名古屋） 日本薬学会
Event date： 2022.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：名古屋（オンライン）
【目的】当研究室では、これまで肝再生の分子機構の解明の一端として、肝再生中に分泌される増殖因子やサイトカインの細胞増殖メカニズムを検討してきた。脳下垂体前葉ホルモンである成長ホルモン（GH）は、細胞の増殖を促進させるホルモンであり、肝再生にも大きく影響を及ぼす。GHの細胞増殖促進作用は、JAK/STAT/IGF-I経路を介することが知られているが、近年、その他にも様々な経路により標的器官の細胞分裂を起こしていることが明らかとなってきている。本研究では初代培養肝実質細胞を用いて、GHの細胞増殖メカニズムの新たな見解を検討したので報告する。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、種々の濃度のGHまたは特異的シグナル伝達因子阻害薬を添加した。一定時間培養後、肝実質細胞のDNA合成能及び核数を計測した。また、JAK2およびIGF-I受容体チロシンキナーゼ（RTK）のリン酸化活性はWestern blot法を用いて測定した。
【結果及び考察】GHは、初代培養肝実質細胞に対して、用量および培養時間に依存して有意なDNA合成および細胞増殖促進作用を示した。GH誘発肝細胞増殖促進作用は、特異的JAK2阻害薬（TG101209）、特異的PLC阻害薬（U-73122）、特異的IGF-I受容体チロシンキナーゼ阻害薬（AG538）によって有意に抑制された。しかし、特異的STAT3/5阻害薬（SH-4-54）ではGHの肝細胞増殖促進作用を抑制しなかった。また、GHは肝実質細胞のJAK2およびIGF-IRTKのリン酸化活性を有意に促進させ、その上昇ピークはJAK2の方が早かった。これらの結果から、初代培養肝実質細胞におけるGH増殖促進作用はJAK2/PLC/IGF-I RTKを介することが明らかとなった。 -
Signal transduction mechanism for autocrine secretion of insulin-growth factor type 1 by S-allyl-L-cysteine in primary cultures of adult rat hepatocytes
Event date： 2022.03 - 2203.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
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部分肝切除ラットにおけるERKおよびAktリン酸化活性に対するS-allyl-L-cysteineの促進効果の検討
石井 貴久、赤木 友香、栗原 一樹、茂木 肇、荻原 政彦、木村 光利
第65回日本薬学会関東支部大会（千葉） 日本薬学会関東支部
Event date： 2021.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：千葉（オンライン）
【目的】S-Allyl-L-cysteine (SAC) は、熟成ニンニクに含まれる含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化作用や抗炎症作用などがあることから、健康補助食品に利用されている。さらに過去の我々の研究で、部分肝切除ラットにおいてSACが肝再生を促進させることが明らかとなった。しかし、SACの肝再生促進作用のメカニズムは未だ不明な部分が多い。本研究では、細胞増殖に関わりの深いタンパク質であるERK1/2とAktに焦点を当て、Western blot解析法を用いて、部分肝切除ラットにおけるERK1/2およびAktリン酸化活性に対するSACの効果について検討した。
【方法】Wistar系雄性ラットにHigginsらによる70％部分肝切除術を施行し、肝再生モデル動物を作成した。モデル動物にSAC (300 mg/kg, p.o.) を投与し、一定期間飼育した後、残余肝を摘出した。残余肝からトライゾール試薬により抽出したタンパク質を基にWestern blot解析法を用いてERK1/2およびAktのリン酸化活性を測定した。
【結果および考察】部分肝切除後のSAC投与群において、ERK2およびAktリン酸化活性は、切除後3時間と6時間で有意差に増加した。一方、ERK1リン酸化活性は部分肝切除24時間まで有意差が認められなかった。これにより、SACは、ERK2およびAktのリン酸化を促進させることにより肝再生を促進させると考えられる。 -
成熟ラット初代培養肝実質細胞に対するN-acetyl-S-phenyl-L-cysteineの細胞増殖促進作用機構の検討
浅田 健一、石垣 太基、栗原 一樹、茂木 肇、荻原 政彦、 木村 光利
第65回日本薬学会関東支部大会（千葉） 日本薬学会関東支部
Event date： 2021.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：千葉（オンライン）
【目的】N-Acetyl-S-phenyl-L-cysteine (Nac-SPC) は、L-cysteineの誘導体であるS-allyl-L- cysteine (SAC)のallyl基がphenyl基に置換し、さらにN-acetyl化された水溶性化合物である。SACは過去の我々の研究において、初代培養肝実質細胞増殖促進作用が認められているが、Nac-SPCは、SACのような細胞増殖促進作用は報告されていない。そこで、本研究では、初代培養肝実質細胞を用いてNac-SPCの細胞増殖促進作用とその作用メカニズムについて薬理学的な検討を行った。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に培地交換し、Nac-SPCおよび特異的シグナル伝達因子阻害薬を添加し一定時間培養した。培養後、Triton-X100で肝実質細胞の細胞膜を溶かし、裸核を得て、その核数を血球計算盤により計測した。
【結果および考察】Nac-SPCは初代培養肝実質細胞に対して用量および培養時間に依存して細胞増殖促進作用を示した。さらにNac-SPCにより誘発された肝実質細胞増殖促進作用は、PD98059、LY294002およびrapamycinにより抑制された。これによりNac-SPCによる肝実質細胞増殖促進作用は、少なくともMEK、PI3KおよびmTORが関与していると考えられる。 -
成熟ラット初代培養肝実質細胞に対するS-phenyl-L-cysteineの細胞増殖促進作用機構の検討
伊藤 元気、江口 佑太、栗原 一樹、茂木 肇、荻原 政彦、 木村 光利
第65回日本薬学会関東支部大会（千葉） 日本薬学会関東支部
Event date： 2021.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：千葉（オンライン）
【目的】S-Allyl-L-cysteine (SAC) は、熟成ニンニクに含まれる含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化作用や抗炎症作用を示す他、細胞増殖促進作用も示すことが、過去の我々の研究において明らかとなっている。一方、SACのallyl基がphenyl基に置換されたS-phenyl-L-cysteine (SPC) は、ベンゼンによる暴露の潜在的なバイオマーカーとして利用されているが、SACのような細胞増殖促進作用は報告されていない。そこで、本研究では、初代培養肝実質細胞を用いてSPCの細胞増殖促進作用とその作用メカニズムについて薬理学的な検討を行った。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に培地交換し、SPCおよび特異的シグナル伝達因子阻害薬を添加し一定時間培養した。培養後、Triton-X100で肝実質細胞の細胞膜を溶かし、裸核を得て、その核数を血球計算盤により計測した。
【結果および考察】SPCは肝実質細胞に対して、用量および培養時間に依存して細胞増殖促進作用を示した。さらにSPCによって誘発された肝実質細胞増殖促進作用は、PD98059、LY294002およびrapamycinにより抑制された。これによりSPCによる肝実質細胞増殖促進作用は、少なくともMEK、PI3K、mTORが関与していると考えられる。 -
70％部分肝切除ラットにおけるS-allyl-L-cysteineの肝再生促進作用はIGF-1とその受容体のmRNAの発現量増加を介する
栗原 一樹、茂木 肇、夏目 秀視、荻原 政彦、木村 光利
日本薬学会第141年会（広島） 日本薬学会
Event date： 2021.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：広島（オンライン）
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In vivo S-allyl-L-cysteine and some analogues accelerate liver regeneration in 70% partially hepatectomized rats.
Event date： 2021.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
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Signal transduction mechanism for S-allyl-L-cysteine-induced cell proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes
Event date： 2021.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
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ラット初代培養肝実質細胞におけるEGF誘発細胞増殖促進作用に対する葉酸およびテトラヒドロ葉酸の抑制効果に関する研究
高橋 智也、栗原 一樹、茂木 肇、荻原 政彦、木村 光利
第64回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2020.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：オンライン
【目的】葉酸（FA）はビタミンB群の一種であり、核酸塩基の生合成等に関わることから、細胞の増殖に重要な役割を果たしている。一方、いくつかの報告においてFAは細胞増殖抑制作用も有することが明らかになってきており、我々の過去の研究においても、FAがEGF誘発肝実質細胞増殖促進作用を抑制することが明らかとなっている。本研究ではFAの細胞増殖抑制作用の詳細を検討するため、ラット初代培養肝実質細胞におけるEGF誘発細胞増殖促進作用に対するFAとその代謝産物であるテトラヒドロ葉酸（THF）の増殖抑制効果の比較検討を行った。
【方法】In situコラゲナーゼ還流法により、成熟ラットから肝実質細胞を単離し、初代培養を行った。細胞接着後、無血清培地に交換し、EGF(20 ng/ml)および種々の濃度のFAやTHFまたはメトトレキサート（MTX）を添加し一定時間培養した。培養後、Triton-X100で肝実質細胞を裸核し、その核数を血球計算盤により計測した。
【結果および考察】FAおよびTHFは、EGF誘発肝実質細胞増殖促進作用に対し用量依存的に抑制効果を示した。一方、MTX共存下ではFAの増殖抑制効果のキャンセルが認められ、その核数はEGF単独と同等の値を示した。これに対し、THFの増殖抑制効果はMTX共存下においても影響を及ぼさなかった。これらにより、FAは細胞内でTHFに代謝されたのちEGF誘発肝実質細胞増殖促進作用を抑制したと考えられる。 -
HepG2細胞に対するTG101209の細胞増殖抑制作用に関する研究
和田 一美、持田 真生、糸永 直人、栗原 一樹、茂木 肇荻原 政彦、木村 光利
第64回日本薬学会関東支部大会 日本薬学会関東支部
Event date： 2020.09
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：オンライン
【目的】ヒト肝癌細胞HepG2の増殖には、インターロイキン6（IL-6）のような炎症性サイトカインの過剰発現が関与しているといわれている。IL-6は、JAK/STAT経路を活性化させることが知られているが、HepG2細胞の増殖において、JAK/STAT経路を介した詳細なメカニズムについては不明な部分が多い。本研究では、特異的JAK2阻害薬であるTG101209を用いて、HepG2細胞の増殖能、タンパク質リン酸化活性（JAK2、MAPK）を測定し、JAK/STAT経路の関与について検討した。
【方法】HepG2細胞を1.0×104 cells/cm2になるよう播種し、5%FBS含有DMEMにより一晩接着培養させた。培養後、Triton-X100で肝実質細胞を裸核とし、その核数を血球計算盤により計測した。また、JAK2やMAPKのリン酸化活性はWestern blot解析法を用いて測定した。
【結果および考察】HepG2細胞の増殖に関し、培養5日目においてTG101209の用量に依存して有意な核数の減少が認められた。また、HepG2細胞のJAK2リン酸化活性は、TG101209（3.0×10-7M）の添加により有意な抑制が認められた。一方、TG101209はMAPKリン酸化活性に影響を及ぼさなかった。これにより、HepG2細胞は、JAK2を介してその増殖を促進していると考えられる。 -
70％部分肝切除ラットにおける含硫アミノ酸誘導体S-ally-L-cysteineの肝再生促進作用の検討
栗原 一樹、茂木 肇、荻原 政彦、木村 光利
日本薬学会第140年会（京都） 日本薬学会
Event date： 2020.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation
Venue：国立京都国際会議場
【目的】当研究室では、肝再生現象の in vivo モデル実験系として、70 %部分肝切除（70% PH）を施した ラットを用いて、肝再生を促進する薬物の探索を検討してきた。その一連の研究の中で、含硫アミノ酸 L-cysteine (Cys)の誘導体の一種であるS-allyl-L-cysteine (SAC)が肝再生促進作用を有することを見出した。そ れまでSACは、構造中の硫黄(S)原子による抗炎症作用により組織修復を促進すると考えられていた。一 方、L-CysのS原子にメチル基が結合したS-methyl-L-cysteine(SMC)では 、エタノール誘発急性肝障害に対し て、抗炎症作用が認められているが、肝再生に対する効果は不明である。そこで本研究は、SACとSMCの肝再 生促進作用を肝重量やDNA合成能を測定することで評価した。
【方法】Wistar系雄性ラットにイソフルラン麻酔下で70% PHを施行し、肝再生モデル動物を作製し た。種々の用量のSACあるいはSMCを、術直後より1日1回腹腔内投与し、一定期間飼育した。その 後、BrdU(50 mg/kg, i.p.)を前投与し、採血した後、残余肝を摘出し、その肝重量を測定した。さらにその残余 肝をホルマリン固定・パラフィン包埋・薄切し、組織切片を作製した。肝組織切片はBrdU Immunohistochemistry Kitにて、肝細胞の核に取り込まれたBrdUを染色し、染色された細胞割合(labeling index;LI)を計測し、DNA合成能を評価した。
【結果及び考察】70% PHしたcontrol群では、術後5日目まで穏やかな肝重量の増加を示した。これに対 し、SAC投与群では、術後2日目においてcontrol群と比較し、急激な肝重量の増加が認められた。一 方、SMC投与群ではcontrol群と比較して有意な増加はみられなかった。DNA合成能においても、術後1日目に おいてSAC投与群でcontrol群と比較し、有意な上昇が認められた。一方、SMC投与群ではcontrol群と比較 し、有意な上昇はみられなかった。これらの結果から、70 % PHラットに対する含硫アミノ酸の肝再生促進作 用はL-Cys の S原子に結合したアリル基が寄与することが示唆された。 -
Activation of ribosomal p70 S6 kinase by selective serotonin (5-HT)2B receptor agonist BW723C86 is mediated by epidermal growth factor/transforming growth factor-α receptor tyrosine kinase in primary cultures of adult rat hepatocytes.
Event date： 2020.03
Language：Japanese Presentation type：Poster presentation