Scientific Research Funds Acquisition Results -
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グアニン四重鎖DNAの適切な複製に必要なMgs1機能の解明
Grant number：23K05014 2023.04 - 2026.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
赤沼 元気
Grant amount：\4810000 （ Direct Cost: \3700000 、 Indirect Cost：\1110000 ）
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慢性的DNA損傷ストレス耐性におけるリボソームの役割
Grant number：20K05790 2020.04 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
赤沼 元気
Grant amount：\4160000 （ Direct Cost: \3200000 、 Indirect Cost：\960000 ）
本年度は主に、染色体異数化によるリボソームタンパク質遺伝子欠損株の増殖速度回復と、DNA損傷ストレス耐性低下に関する解析を行った。
リボソームタンパク質L42B欠損株以外にも、6種のリボソームタンパク質欠損株について、染色体異数化による増殖速度回復が見られるかを検討し、全てのサプレッサー変異株でパラログ遺伝子がコードされている染色体の倍加を確認した。これらの株では、DNA損傷剤や複製阻害剤への感受性増加が認められたが、感受性増加の程度は株によって大きく異なっており、増加した染色体とパラログ遺伝子の種類によってDNA損傷ストレス耐性への影響は変化すると考えられた。
出芽酵母は通常１倍体として増殖するが、２倍体化することで環境に適応する例が知られている。L42B欠損株でも2倍体化によりパラログ遺伝子が2コピーとなるため、増殖速度の回復が予想されるが、L42B欠損株から細胞増殖速度が回復した２倍体は得られていない。そこで、２倍体細胞のL42BとL42Aの遺伝子コピー数を制限した株を作製して調査した。L42A遺伝子のみ２コピー保持する2倍体株の増殖速度は１倍体のL42B欠損株とほとんど変わらず、80Sやpolysomeの含有量の増加も認められなかった。恐らく2コピーのL42A遺伝子では2倍体細胞に十分な量のリボソームタンパク質を供給できないことが原因と考えられる。
L42B欠損株のサプレッサー変異株ではDNA損傷ストレス耐性が低下するが、この表現型を抑圧する変異株の単離を試みた。サプレッサー変異株からMMS耐性株を選択し、そこから異数性が解消された株を除いた。これらの株のゲノム塩基配列を次世代シーケンサーで解析したところ、多くの変異がリボソーム合成や翻訳に関わる遺伝子から検出された。今回の結果は細胞の翻訳活性低下がタンパク質の不均衡解消に一定の効果があることを示すものである。 -
Elucidation of molecular mechanism of super-induced secretion of lipase and construction of useful protein mass production system
Grant number：18K05414 2018.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Grant amount：\4290000 （ Direct Cost: \3300000 、 Indirect Cost：\990000 ）
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Investigation of the relationship between intracellular Mg2+ concentration and ribosomes
Grant number：17K15253 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Akanuma Genki
Grant amount：\4290000 （ Direct Cost: \3300000 、 Indirect Cost：\990000 ）
We investigated the influence of the change of intracellular Mg2+ concentration on the ribosomes. Excess Mg2+ reduced the cellular translational activity and induced the transcription of rRNA. When decreasing the intracellular Mg2+ concentration, the amount of 70S ribosome was significantly decreased. These results suggest that the ribosomes which can chelate 25% of Mg2+ in the cell are involved in the Mg2+ homeostasis.
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The regulatory mechanisms of the induction of lipase expression and polyester production by stearyl alcohol
Grant number：26450101 2014.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
AKANUMA Genki
Grant amount：\5070000 （ Direct Cost: \3900000 、 Indirect Cost：\1170000 ）
The transcriptional factor which activates the transcription of gene encoding lipase was determined. Moreover, we found the alcohol dehydrogenase which plays important role for induction of lipase expression by stearyl alcohol. The EliA, a secretory protein, is essential for the lipase-producing bacterium to respond to stearyl alcohol.
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The studies for the regulatory mechanism of lipA and for function of the surfactant protein, EliA, in Ralstonia sp. NT80.
Grant number：23780090 2011 - 2013
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
AKANUMA Genki
Grant amount：\4290000 （ Direct Cost: \3300000 、 Indirect Cost：\990000 ）
Stearyl alcohol induced not only the expression of lipase and infection-related secreted proteins but also the synthesis of PHB in Ralstonia sp. NT80. The secreted protein, EliA, was also induced by stearyl alcohol and facilitated induction of lipase expression. The content of stearyl alcohol in the culture supernatant was reduced by wild-type cells but not by eliA cells. It is most likely that EliA facilitates the induction of lipase expression, by promoting the recognition and/or incorporation of stearyl alcohol.
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Elucidation of the molecular mechanism of lipase super-induction and creation of high stereo-selective lipase.
Grant number：23580119 2011 - 2013
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
ISHIZUKA Morio, AKANUMA Genki, USHIO Kazutoshi
Grant amount：\5460000 （ Direct Cost: \4200000 、 Indirect Cost：\1260000 ）
Stable and high stereo-selective lipase has attracted attention from the viewpoint of industrial usage. As compared with the case where it was olive growing, the addition of stearyl alcohol resulted in enhanced several tens folds of thermo-stable and high stereo-selective lipase activity. Not only lipase but also surface active protein (EliA) was strongly induced in a large amount and secreted. From our experimental results, We can propose a model of lipase super-production system as follows: uptake of a small amount of lipase super-inducer, induction of EliA and secretion, emulsification of stearyl alcohol by EliA, uptake of a large amount of lipase super-inducer, and strong induction of lipase and secretion. It has become possible to obtain a large amount of high stereo-selective lipase by application of the mechanism.
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S. griseusにおける二次代謝、形態分化制御蛋白質のプロテオーム解析
Grant number：07J07090 2007 - 2009
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
赤沼 元気
Grant amount：\3300000 （ Direct Cost: \3300000 ）
放線菌Streptomyces griseusは、自身が生産する低分子調節物質A-ファクターにより、グローバルな転写活性因子であるAdpAの発現を活性化し、形態分化・二次代謝を誘導する。受入研究室ではこれまで、複数の分泌プロテアーゼやプロテアーゼ阻害タンパク質の生産がA-ファクターによって誘導されることを示し、形態分化に分泌プロテアーゼが重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。昨年度までに、野生株とadpA破壊株の菌体外蛋白質の比較プロテオーム解析を行い、多くの分泌タンパク質がA-ファクターによって発現誘導されていることを示した。また転写解析も併せて行い、AdpAによって直接的な発現制御をうける分泌蛋白質遺伝子を新たに11種見出している。本年度は昨年度までの解析で、A-ファクター依存性分泌蛋白質であることが示されたSGR2418を基質結合蛋白質として有するオリゴペプチドABCトランスポーターの機能解析を行った。
S.coelicolor A3(2)では菌体外に生産されるペプチドがシグナル分子として形態分化に関与しており、ペプチド取込みABCトランスポーターをコードするbldKオペロンの変異株は気中菌糸を形成しない。一方、S.griseusのゲノムにはBldKホモログは見出されていない。しかし、SGR2418を含むオペロン周辺の遺伝子配置はS.coelicolor A3(2)、bldK周辺の遺伝子配置と類似していた。SGR2418の遺伝子破壊株は気中菌糸形成能を失っていたが、野生株と近接させて培養すると気中菌糸を形成した。また、ペプチド系抗生物質であるビアラボスへの耐性能も向上していた。これらの結果から、SGR2418を含むオペロンがS.griseusにおいてbldK機能を担っていることを示した。